基于多组学分析的脂肪肝患者肝功能指标与疾病进展关联性研究
基于多组学分析的脂肪肝患者肝功能指标与疾病进展关联性研究
摘要
目的：探讨脂肪肝患者肝功能指标与疾病进展的关联性，利用多组学分析方法揭示潜在的分子机制。方法：选取200例脂肪肝患者，分为轻度（80例）、中度（70例）和重度（50例）三组。检测肝功能、血脂和炎症因子水平，进行基因组学、转录组学、代谢组学和蛋白质组学分析。结果：随着脂肪肝程度加重，ALT和AST水平显著升高（P＜0.05）；重度组的TC和TG水平最高（P＜0.05）；炎症因子hs-CRP在重度组显著升高（P＜0.05）。PNPLA3基因I148M突变在重度组的检出率为48%，高于轻度组的15%（P＜0.05）。转录组学分析发现脂质合成和炎症相关基因显著上调。结论：肝功能损伤、脂质代谢紊乱、炎症反应和遗传因素共同促进了脂肪肝的进展，多组学分析为揭示其发病机制提供了新视角。
关键词：脂肪肝；肝功能指标；多组学分析；疾病进展；PNPLA3基因
引言
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是全球范围内最常见的慢性肝病，其发病率随着肥胖和代谢综合征的流行而迅速上升。NAFLD的病理谱广泛，从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纤维化，甚至发展为肝硬化和肝细胞癌。但是其确切的发病机制仍未完全阐明，需要深入研究。
前人的研究表明，脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗和炎症反应在NAFLD的发生和进展中起关键作用[1]。一些基因，如PNPLA3，被发现与NAFLD的易感性和严重程度相关[2]。但是关于肝功能指标如何与疾病进展关联，以及多组学分析如何揭示潜在机制，尚缺乏系统的研究[3]。
本研究通过检测不同程度脂肪肝患者的肝功能、血脂和炎症因子水平，结合基因组学、转录组学、代谢组学和蛋白质组学分析，探讨肝功能指标与疾病进展的关联性，揭示潜在的分子机制，为NAFLD的早期诊断和个体化治疗提供新的思路。
1.1 一般资料
本研究共纳入2020年1月至2022年12月在本院就诊的脂肪肝患者200例。其中，男性120例，女性80例；年龄范围为30～65岁，平均年龄为（47.5±8.2）岁。所有患者均符合《中国非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2018年修订版）》中的诊断标准，经过腹部超声或磁共振成像（MRI）确诊为脂肪肝。
纳入标准：年龄在18～70岁之间的成年人；经影像学检查确诊为脂肪肝；无酒精滥用史（男性饮酒量＜30g/d，女性＜20g/d）；自愿参加本研究并签署知情同意书。
排除标准：合并其他肝脏疾病，如病毒性肝炎、药物性肝损伤、自身免疫性肝炎等；患有严重的心血管、肾脏或内分泌疾病；妊娠或哺乳期妇女；近3个月内使用影响肝功能的药物。
根据肝脏脂肪变性程度，患者分为轻度脂肪肝组（n=80）、中度脂肪肝组（n=70）和重度脂肪肝组（n=50）。各组在性别、年龄、体质指数（BMI）等一般资料方面差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性[4]。
1.2 方法
1.2.1 样本采集
所有受试者均于清晨空腹状态下采集静脉血5 mL，置于抗凝管中，3000 rpm离心10分钟，分离血清后储存在-80℃冰箱中备用。对于接受肝组织活检的患者，获取肝组织样本，立即置于液氮中冷冻保存，供后续分子生物学分析。
1.2.2 临床指标检测
利用全自动生化分析仪检测患者的肝功能指标，包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）和直接胆红素（DBIL）。同时测定血脂指标，如总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）。
1.2.3 多组学分析
1.2.3.1 基因组学分析
从肝组织样本中提取基因组DNA，采用高通量测序技术进行全基因组测序（WGS），分析与脂肪肝相关的基因突变和多态性。
1.2.3.2 转录组学分析
提取肝组织总RNA，利用RNA测序技术（RNA-seq）获取基因表达谱。使用生物信息学方法鉴定差异表达基因，探讨脂肪肝进展中的关键调控基因。
1.2.3.3 代谢组学分析
采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）对血清样本进行非靶向代谢组学分析。通过质谱数据比对，鉴定差异代谢物，揭示脂肪肝患者体内的代谢变化。
1.2.3.4 蛋白质组学分析
利用双向凝胶电泳结合质谱鉴定（2-DE/MS）技术，对肝组织蛋白质进行分离和鉴定。筛选差异表达蛋白质，分析其在脂肪肝疾病进展中的作用。
1.2.4 数据分析
使用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x̄±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。多组学数据的处理采用相关生物信息学软件，进行质量控制、比对和功能注释。利用KEGG和GO数据库进行通路和功能富集分析。
1.3 观察指标
1.3.1 肝功能指标
测定患者血清中的谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平，以评估肝细胞的损伤程度。ALT和AST是反映肝功能的重要酶学指标，其升高程度与脂肪肝的严重程度密切相关。
1.3.2 血脂指标
检测血清中的总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平，了解患者的脂质代谢状况。异常的血脂水平可能促进脂肪在肝脏的沉积，加重脂肪肝的进展。
1.3.3 炎症因子
测定超敏C反应蛋白（hs-CRP）的水平，评估全身炎症状态。hs-CRP是反映体内炎症反应的重要指标，炎症在脂肪肝的发生和进展中起关键作用。
1.3.4 多组学指标
通过多组学分析，检测患者特定基因的多态性、差异表达的基因和蛋白质，以及血清中的差异代谢物水平。探讨这些分子指标与脂肪肝疾病进展之间的关联性。
1.4 统计学分析
所有数据均采用SPSS 25.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x̄±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，相关性分析使用Pearson或Spearman相关分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 肝功能指标比较
随着脂肪肝程度的加重，患者的肝功能指标显著升高（P＜0.05）。重度脂肪肝组的ALT和AST水平明显高于轻度和中度组，提示肝细胞损伤程度与疾病进展密切相关。
表1：不同程度脂肪肝患者的肝功能指标比较
组别 例数(n) ALT(U/L) AST(U/L) TBIL(μmol/L) DBIL(μmol/L)
轻度脂肪肝组 80 35.2±8.5 30.1±7.2 12.3±3.1 5.6±1.4
中度脂肪方肝组 70 45.6±9.3 40.5±8.7 15.8±3.5 7.2±1.6
重度脂肪方肝组 50 60.8±11.4 55.2±10.6 18.6±4.2 9.1±2.0
P值 — <0.05 <0.05 <0.05 <0.05
2.2 血脂指标比较
血脂水平在各组间差异显著（P＜0.05）。重度脂肪肝组的TC和TG水平最高，HDL-C水平最低，说明脂质代谢紊乱在脂肪肝进展中起重要作用。
表2：不同程度脂肪肝患者的血脂指标比较
组别 例数(n) TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L)
轻度脂肪肝组 80 5.2±0.8 1.8±0.5 1.3±0.3 3.0±0.7
中度脂肪肝组 70 5.8±0.9 2.4±0.6 1.1±0.2 3.5±0.8
重度脂肪肝组 50 6.5±1.0 3.1±0.7 0.9±0.2 4.0±0.9
P值 - <0.05 <0.05 <0.05 <0.05
2.3 炎症因子水平比较
hs-CRP水平随脂肪肝严重程度增加而显著升高（P＜0.05）。重度组的hs-CRP水平最高，表明炎症反应在疾病进展中愈发显著。
表3：不同程度脂肪肝患者的hs-CRP水平比较
组别 例数(n) hs-CRP(mg/L)
轻度脂肪方肝组 80 2.1±0.6
中度脂肪肝组 70 3.7±0.8
重度脂肪方肝组 50 5.5±1.1
P值 - <0.05
2.4 多组学分析结果
2.4.1 基因组学结果
PNPLA3基因I148M突变在重度脂肪肝患者中检出率最高，显著高于轻度和中度组（P＜0.05），暗示该基因突变可能促进疾病进展。
表4：PNPLA3基因I148M突变在各组的检出情况
组别 例数(n) 突变例数(n) 突变率(%)
轻度脂肪肝组 80 12 15%
中度脂肪肝组 70 21 30%
重度脂肪肝组 50 24 48%
P值 — — <0.05
2.4.2 转录组学结果
共鉴定出256个差异表达基因，其中上调180个，下调76个。上调基因主要与脂质合成和炎症通路相关。
表5：部分差异表达基因列表
基因名称 表达变化 功能注释
SREBP1 上调2.5倍 脂质合成调控因子
TNF-α 上调3.0倍 炎症细胞因子
IL-6 上调2.8倍 促炎症因子
PPAR-α 下调1.8倍 脂肪酸氧化调节
ACC1 上调2.2倍 脂肪酸合成关键酶
2.4.3 代谢组学结果
代谢组学分析发现，重度脂肪肝患者血清中关键代谢物水平显著变化（P＜0.05）。
表6：差异代谢物水平比较
代谢物 轻度组(n=80) 中度组(n=70) 重度组(n=50) P值
游离脂肪酸(μmol/L) 450±80 520±90 610±100 <0.05
甘油三酯(mmol/L) 1.8±0.5 2.4±0.6 3.1±0.7 <0.05
乳酸(mmol/L) 1.2±0.3 1.5±0.4 1.9±0.5 <0.05
丙酮酸(μmol/L) 85±15 95±18 110±20 <0.05
2.4.4 蛋白质组学结果
检测到42种差异表达蛋白质，重度组中与氧化应激和细胞凋亡相关的蛋白质显著上调。
表7：部分差异表达蛋白质列表
蛋白质名称 表达变化 功能注释
MDA 上调2.8倍 氧化应激指标
Caspase-3 上调3.2倍 细胞凋亡执行蛋白
NF-KB 上调2.5倍 炎症信号通路关键因子
SOD 下调1.7倍 抗氧化酶
Bcl-2 下调2.0倍 抗凋亡蛋白
3 讨论
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已成为全球范围内最常见的慢性肝病之一，其发病率随着肥胖和代谢综合征的流行而迅速上升。NAFLD的病理谱从单纯性脂肪变性发展到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纤维化，甚至肝硬化和肝细胞癌。但是其确切的发病机制仍未完全明晰，需要深入研究。
之前研究表明，脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗和炎症反应在NAFLD的发生和进展中起关键作用[6]。一些多组学研究已发现特定基因突变（如PNPLA3 I148M）与NAFLD的易感性和严重程度相关[7]。同时，炎症因子如TNF-α、IL-6的表达上调，以及氧化应激的增强，都被认为是促进疾病进展的重要因素[8]。
我们研究发现，随着脂肪肝程度的加重，患者的ALT和AST水平显著升高。具体而言，轻度脂肪肝组的ALT和AST分别为（35.2±8.5）U/L和（30.1±7.2）U/L，重度组则升高至（60.8±11.4）U/L和（55.2±10.6）U/L（P＜0.05）。这表明肝细胞损伤程度与脂肪肝的严重程度密切相关。前人的研究也支持这一观点，指出ALT和AST是评估肝细胞损伤的重要指标，其升高程度与NAFLD的进展呈正相关[9]。其次血脂指标的紊乱。数据显示，重度脂肪肝组的总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平显著高于轻度和中度组（P＜0.05）。重度组的TC和TG分别达到（6.5±1.0）mmol/L和（3.1±0.7）mmol/L，而轻度组仅为（5.2±0.8）mmol/L和（1.8±0.5）mmol/L。这说明脂质代谢紊乱在脂肪肝的发生和进展中起重要作用。与既往研究一致，血脂异常被认为是NAFLD的重要危险因素，可能通过促进肝内脂质沉积加重疾病进展。我们发现，炎症因子hs-CRP在重度脂肪肝患者中显著升高，达到（5.5±1.1）mg/L，明显高于轻度组的（2.1±0.6）mg/L（P＜0.05）。这提示全身性炎症反应在NAFLD的进展中愈发显著。前人的研究也表明，炎症因子的过度表达可导致肝细胞损伤和纤维化。还有多组学分析揭示了遗传和分子层面的变化。我们的基因组学结果显示，PNPLA3基因I148M突变在重度脂肪肝患者中的检出率高达48%，显著高于轻度组的15%（P＜0.05）。这一结果支持了先前研究关于PNPLA3突变与NAFLD易感性相关的结论。转录组学分析中，脂质合成相关基因SREBP1和炎症因子TNF-α在重度组中分别上调了2.5倍和3.0倍。这些基因的过度表达可能促进脂质积聚和炎症反应。代谢组学结果显示，重度组患者的游离脂肪酸水平升高至（610±100）μmol/L，显著高于轻度组的（450±80）μmol/L（P＜0.05）。这进一步证实了脂质代谢紊乱在疾病进展中的作用。
这结果意味着，NAFLD的发生和进展是多因素、多层次作用的结果。脂质代谢紊乱导致脂肪在肝细胞内过度沉积，继而引发炎症反应和氧化应激，加重肝细胞损伤[10]。而且遗传易感性如PNPLA3基因突变可能使患者更容易进展为重度脂肪肝。这些发现为NAFLD的早期诊断和个体化治疗提供了新的思路。
总结
本研究通过对200例脂肪肝患者的多组学分析，发现随着疾病程度的加重，肝功能指标ALT和AST显著升高，血脂水平紊乱，炎症因子hs-CRP明显增加。重度脂肪肝患者中PNPLA3基因I148M突变的检出率高达48%，显著高于轻度患者的15%。转录组学和蛋白质组学分析揭示了脂质合成、炎症和细胞凋亡相关基因和蛋白质的显著变化。这些结果表明，肝功能损伤、脂质代谢紊乱、炎症反应和遗传因素共同促进了脂肪肝的进展。
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